这里以提取一个视频中单分子荧光信号变化曲线为例，展示以前述ImageJ进阶教程的内容为基础的综合应用。

通常我们想提取一个单分子的荧光变化曲线，手动的做法是选中一个单分子区域后，使用 Image>Stacks>Plot Z-axis Profile 功能，然后就会出来一条曲线，然后保存数据，保存ROI。重复上述步骤若干次。

上述操作显然费时费力，而且选取的矩形框ROI很难保持一致。那么通过对进阶教程进行学习之后，这个分析过程是可以大幅度提速的。先确定思路：

• 做一个 Z Max project，确定所有单分子的 xy 坐标，可以用 Find Maxima 搞定
• 遍历每个单分子，选择一个固定大小的矩形ROI
• 滑动Slice，对ROI内的像素进行统计，包括最大值，最小值，均值，方差等等
• 将提取的数据保存到 Results 窗口，完成后可以选中强度和时间两列快速plot

最大强度投影

什么是最大强度投影？就是在指定 xy 坐标位置的像素，取所有z axis（或者时间点）上这个位置的像素的最大值。

为何要进行最大强度投影呢？因为有些单分子的信号，不是在第一帧就出现的。但是它总归会出现，而且信号强于背景，得看最大值。（反例，如果想看这个视野的背景，可以使用最小强度投影）

怎么做？ImageJ菜单栏直接点进去，Image>Stacks>Z Project.. 可以打开弹窗，选择 Max Intensity即可。

Find Maxima

在所得最大投影图像中，使用 Find Maxima 功能，找到所有的点并获取坐标。可以先手动 Find，然后开启预览，方便设置 Prominence：

由于Find Maxima 输出为 List 是保存到 Results 窗格中。为了方便，我们这里封装一个函数，把坐标返回到一个数组中，方便后面遍历：

制作矩形框并统计

获得点的坐标之后，我们接下来就是要进行自动选取和像素统计，这里可以先手动输入其中一个点的坐标，测试下这个主要的功能。

上图演示代码中简单介绍：

• floor是对浮点值向下取整，比如 5.3 和 5.9 都会变成5。而 round 是对浮点值最近取整，0.5取1，0.49取0。这里使用 floor 或者 round 都可以，主要是获得绘制矩形ROI的起始坐标
• 使用 makeRectangle 制作矩形ROI，使用 getStatistics 进行像素统计

由于这是一个需要多次被调用的步骤，我们也可以封装成一个函数，方便调用，代码如下：

遍历stack完成数据提取

有了以上两个原子级别的函数，接下来我们就需要整合到整个处理流程中，完成每个单分子信号的数据提取。这里我们可以定义最初的整个 stack 作为原始输入，最后输出的是一个 Results 表格。表格中包含以下内容：

• 时间（t）
• 坐标（x,y）
• 强度（mean, min, max, std）
• 颗粒索引（pid），方便后续根据不同的颗粒进行分组

完整代码如下：

注意在ImageJ的代码编辑器中，上方主要逻辑代码和前面两个自定义函数需要放到一起。

点击图像 stack 创库，然后 run，就会自动统计并生成一个表格，如下所示：

这个表格相对复杂，如果想查看某个单分子的强度随时间变化曲线，可以保存表格，后续使用 python 或者 excel 按照 pid 进行分组然后作图查看。