单分子定位精度

最近有同学问我单分子成像（DNA-PAINT/STORM等）的定位精度。

单分子定位成像的定位精度通常通过分析单分子荧光信号的点扩散函数（Point Spread Function, PSF）来计算。定位精度的计算主要基于荧光信号的光子统计和背景噪声，常用公式和方法如下：

单分子定位的精度通常由以下公式描述（假设高斯分布的PSF）：

$\sigma_{xy} = \sqrt{\frac{s^2 + a^2/12}{N} + \frac{8\pi s^4 b^2}{a^2 N^2}}$

其中：

$\sigma_{xy}$ ：定位精度（x或y方向的标准偏差，单位通常为纳米）。

$s$ ：PSF的标准偏差（与显微镜的分辨率相关，取决于数值孔径和波长）。

$a$ ：相机像素的物理尺寸。

$N$ ：采集到的光子数。

$b$ ：背景噪声的光子数（每像素）。

这个公式考虑了以下因素：

光子统计噪声：由采集光子数的有限性引起（第一项）。

像素化噪声：由于相机像素的有限尺寸（第一项中的 $a^2/12$ ）。

背景噪声：背景光子对信号的干扰（第二项）。

当背景噪声较低且像素尺寸较小（即 $a \ll s$ ）时，公式可简化为：

$\sigma_{xy} \approx \frac{s}{\sqrt{N}}$

这表明定位精度主要取决于PSF的宽度和采集的光子数。更多的光子数（ $N$ ）会显著提高定位精度。

在实验中，定位精度的计算通常通过以下步骤实现：

采集单分子荧光图像：使用高灵敏度的相机（如EMCCD或sCMOS）记录单分子荧光信号。

拟合PSF：对单分子荧光点的强度分布进行二维高斯拟合，确定中心位置和PSF宽度（ $s$ ）。

统计光子数：计算单分子信号的总光子数（ $N$ ）和背景噪声（ $b$ ）。

代入公式：将上述参数代入定位精度公式，计算 $\sigma_{xy}$ 。

光子数（ $N$ ）**：光子数越多，定位精度越高。通常需要至少几百到几千个光子。

背景噪声（ $b$ ）**：高背景噪声会降低定位精度，因此需要优化显微镜设置（如降低激光散射）。

PSF宽度（ $s$ ）**：与显微镜的数值孔径（NA）和荧光波长相关，高NA物镜和短波长荧光通常能获得更窄的PSF。

像素尺寸（ $a$ ）**：像素尺寸过大可能引入像素化误差，需选择合适的放大倍率。

在实际的单分子定位显微镜（如STORM或PALM）中：

定位精度通常在 1-50 nm 范围内，具体取决于实验条件。

高光子数（>5000）和低背景噪声的条件下，精度可达 1-10 nm。