现需要分析大量不同条件和时间点的成像数据，其中一个数据基本如下图所示。需要分析每张图中细胞膜上平均信号强度。
由于同一个条件下同一时间点有大量数据，因此不需要做到单细胞，数据量也足够，所以不需要细胞分割，信号强度的单位是 per image。
根据中心极限定理，很容易预估这个信号平均值服从正态分布。每组数据都是独立样本，后续估计要做 t 检验两两组别间的平均数差异，因此每组13~30张图像（为达到80%以上统计功效，单尾t检验要求最少每组13个样本，双尾t检验最少每组17个样本）比较合适。如果单组图像数量不够，则可以使用 per cell 作为单位，那么有20个左右细胞就差不多了。
关于t检验单双尾，要求数据服从正态分布，单尾检验用于比大小，双尾检验用于判断是否相等
点击 Plugins>Bio-Formats>Bio-Formats Plugins Configuration 设置以 windowless 方式打开 zeiss 的 czi 文件，避免批处理的时候总是弹窗让你确认打开时的 hyperstack 选项。
图像形状简单，图像除了膜上一圈有信号，其它背景很低。auto threshold 效果良好，可以先简单快速地尝试利用 auto threshold 进行批量分析。然后再尝试使用固定 threshold (细胞膜更完整) 进行分析，可以对两种方式的结果进行比较。
然后使用以下 ImageJ Macro 脚本进行统计分析，运行后选择其中一个目录，输出结果到同目录下的 results.csv 文件。
wks = getDirectory("Choose Directory");filelist = getFileList(wks);
print("method,area,mean,min,max,std,lower_threshold,upper_threshold,img_filepath");for (i = 0; i < lengthOf(filelist); i++) { if (endsWith(filelist[i], ".czi")) { open(wks + File.separator + filelist[i]); img = getTitle(); processImg(img); }}
function processImg(img){ run("Duplicate...", "title=cy3 channels=1"); autoT(); fixT(3000, 65535); selectWindow(img); close(); selectWindow("cy3"); close();}
function autoT(){ setAutoThreshold(); getThreshold(lower, upper); run("Create Selection"); getStatistics(area, mean, min, max, std, histogram); print("autoT,"+area+","+mean+","+min+","+max+","+std+","+lower+","+upper+","+img);}
function fixT(lower, upper){ setThreshold(lower, upper); run("Create Selection"); getStatistics(area, mean, min, max, std, histogram); print("fixT,"+area+","+mean+","+min+","+max+","+std+","+lower+","+upper+","+img);}
selectWindow("Log");filepath = wks+File.separator+"results.csv";saveAs("text", filepath);run("Close");[!tip] 代码要点
- 打开目录
- 遍历目录下czi文件
- 批量分析图像
- 打印结果到 Log窗口，符合 csv 逗号分隔符格式
- 将 Log窗口中的内容保存为 csv 文件，但是 format 只能写 text，而不是 results
Macro的使用方法详见：
打开结果表格，可以看到需要统计的信息都已保存，可以按照 method 列进行分组：
基于所有 folder下生成的表格文件，后续可以使用 python 或者其它工具，批量整理汇总并进行统计检验。