ImageJ进阶教程可帮助您提升成像数据分析能力，并完成编程入门。
引言
在搞完基础教程之后，对于要不要继续出一个进阶教程，我是有点犹豫的。因为我希望教程能够帮助更多的人，但是「进阶」往往意味着聚焦到具体的领域，造成其适用性变差。最后可能会变得与网上很多碎片化的教程一样：如果你不做这个细分专业方向，这个教程可能对你毫无帮助。
我想，除了往细分专业方向进阶（主要包括面向具体应用的更复杂的功能和插件的学习），还有一个进阶的方向是掌握一定的编程能力，能够自由地利用脚本，把之前大量手工操作的步骤合并成 「one click run」。我觉得这个是比介绍更具体的各种插件和功能更有价值的事情。
但不得不说，专门教人 ImageJ 编程是不太合适的。ImageJ 的 Macro 并不算是完整编程语言，它只是运行于 ImageJ 内部的一种指令。不过它的优点是包含了面向过程编程的基本思想和最常见的语法，所以借此让用户初步了解编程，是非常合适的。
即便如此，Macro的内容还是非常丰富，我也只能说掌握了一点皮毛。所以这里只能作为一个引路人，结合自己的经历，主要以对点状信号的各种分析，将 ImageJ Macro 编程相关的内容捏碎放入各个完整的实际案例中。
认识宏和编辑器
ImageJ Macro其实非常简单，因为其命令可以通过 Recorder 记录下来，另外很多 builtin-functions，macro examples 可以在官网查到。而且现在借助 AI，写代码也变得更加轻松。所以大家不要一听到编程就犯难，现在真的门槛很低。最重要的是，一旦你掌握了编程核心思想，掌握了 for，if，function这些最基础的东西，你就会发现很多编程语言之间就是方言的关系，再去学学习其他编程语言都会变得轻松。
如何实现自动化
很多时候我们无法一步到位把一套手工流程完全转化为自动流程，所以这里可以先尝试对其中部分步骤进行自动化，这样也能提高不少效率。这里面最重要的就是能够把大问题拆解成能够「for循环」处理的子问题。
如何自定义统计指标
有些时候我们想统计的指标，ImageJ并没有直接提供，需要我们基于一些基础的信息进行换算。比如这里提供的例子，是要获取图像像素的颜色信息，那么我们可以写成「自定义function」，这样就可以方便地在程序中多次调用和移植。与一段程序类似，清晰地定义函数地输入和输出是非常重要的。
综合应用
通过前面的例子，基本上已经把 ImageJ Macro Language 中基本的「for循环」、「if条件判断」、「自定义function」语法，还有常用的一些 bultin functions，常用的一些 command都覆盖了。这里就以一个提取单分子荧光强度变化曲线为例，给大家可以看看怎么组合macro，完成一个复杂一点的工作的自动化。
而掌握了进阶的 ImageJ Macro 编程之后，ImageJ 也能够与其他各种更先进的工具结合，也就是将原本需要手动的一些限速步骤使用第三方工具解决，然后把外部工具的 output 重新作为程序的 input 继续处理。这就是对多种工具的组合应用。在这个方面，我提供了一个通过cellpose代替手工绘制获得细胞轮廓，然后进一步统计细胞膜上的荧光信号强度的例子。
图像预处理
前面所有我都只是讲了怎么利用 ImageJ Macro 来对部分操作进行自动化以提升数据分析能力。其实对于图像分析而言，有一个很重要的前置步骤叫做预处理。预处理其实也可以简单分为两类，一类是不改变原始数据数值的，比如选区和阈值分割之类的以聚焦感兴趣的信号。另外一种就是会轻微改变原始数据数值的，比如降噪拟合提升图像质量啥的。
对于图像选区以分析感兴趣的信号，这个部分的基本原则就是得克服人为引入的统计偏见。但不得不说，即便现在出现了很多基于AI的算法，对于感兴趣目标的识别分割，仍然还是专家肉眼更加准确。所以在数据量不大的情况下，掌握一定的图像选区技巧也很重要。在ImageJ基础教程中我仅介绍了菜单栏有的几种典型 Selection例如矩形或者freehand。实际上还可以对这些选区进行编辑，以满足更复杂一点的选区需求。例子如下：
获取感兴趣的选区从来都是一个费时费力的事情，因为要让计算机很轻松地理解人类的兴趣是比较困难的。好在现在已经有很多AI模型可供使用，而且几乎所有AI模型进行图像分割都能够导出一张 mask 图像。所以这里也介绍了如何使用一段简单的 macro 将 mask 图像转换为 roi，方便使用 ImageJ 基于AI前处理进行后续的分析。
对于预处理提升图像质量，我认为对于绝大部分同学而言，最重要的还是得靠过硬的实验技术产出高质量数据，而不是预处理。但有些时候再怎么做，能产出的数据质量就到这了，咋办？这个时候，就需要不断参考前人已发表文献进行慎重的预处理，例如滤波平滑等等符合规范的预处理操作，以减少噪声对后续数据分析的影响。这里作为进阶教程，还是可以稍微讲一下，所以我就举了一个以傅里叶为基础的去背景的例子。感兴趣的同学可以自行深入了解强大的傅里叶变换的知识。
小结
进阶教程终于搞完了。会不会还有高阶教程呢？可以肯定地说，不会。都说了我的定位是「ImageJ引路人」，引路千里，终有一别。而且现在随着AI兴起，使用 python 进行成像数据分析具有更强大更便捷的优势，所以日常工作中，作为以图像分析混口饭吃的我，使用 python编程的时候更多。
不过这不是说我已经完全不用 ImageJ了。事实上，我还是会经常使用 ImageJ 预分析一些数据，还有使用各种丰富的ImageJ插件。因为绝大部分时候没有必要重复造轮子，相比造轮子，学习插件用法的成本要低得多。
最后分享下进阶教程中用到的示例数据：
通过百度网盘分享的文件：imagej进阶教程用例数据
链接：https://pan.baidu.com/s/1NoYgrozt4sziRDE2POITUA
提取码：viua